无内毒素质粒提取试剂盒(5～15mL)

产品货号：

WH0033

中文名称：

无内毒素质粒提取试剂盒(5～15mL)

英文名称：

EndoFree Mini Plasmid DNA Kit II(5-15mL)

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的去内毒素系统，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1h，方便快捷。质粒提取得率与质粒拷贝数、宿主菌的种类和培养条件等因素有关，每次处理5～15mL过夜培养的细菌培养液，提取多至70μg的质粒DNA。

产品特点：

快速高产：1h左右提取5～70μg质粒。
质粒纯度高：特殊的去内毒素体系配合CP4吸附柱特异吸附核酸，内毒素含量低。
应用广泛：适用于酶切、PCR、测序、连接、转化等常规实验及基因治疗、细胞显微注射、基因沉默、转染等高端实验。

提取实例：

使用本试剂盒提取不同体积的质粒，洗脱体积200μL，低拷贝（pBR322)上样3μL；高拷贝（pBS)上样2μL，1%琼脂糖凝胶，6V/cm，电泳30min。

无内毒素质粒小量提试剂盒提取实例转染效果

使用本试剂盒提取pEGFP质粒转染293T细胞，转染48小时后观察细胞状态检测GFP荧光。

质粒得率：

质粒类型	处理量	得率	质粒
高拷贝质粒	5～15mL	15μg～70μg	pTZ,pUC,pBS,pTG-T
低拷贝质粒	5～15mL	5μg～25μg	pBR322,pACYC及其衍生载体,pSC101 及其衍生载体,SuperCos,pWE15

试剂盒组成：

组分	规格
平衡液BL	30mL
溶液P1	30mL
溶液P2	30mL
溶液P4	30mL
去蛋白液PD	30mL
漂洗液PW	15mL
洗脱缓冲液TB	15mL
RNase A(10mg/ml)	300μL
过滤柱CS	50个
吸附柱CP4	50个
收集管(2mL)	100个

保存条件：
室温(15～25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2～8℃。（注意：当低温贮存时，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以平衡溶液温度）。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月以上。加入RNase A后的溶液P1应置于2～8℃保存，可稳定保存6个月。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)

溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2～8℃保存。
第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm （~13400×g)。
提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量，洗脱缓冲液应在65～70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
实验前使用平衡液处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。

使用方法：

柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
取5～15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm （~13400×g)离心1min，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1 （请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
向离心管中加入500μL溶液P4，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，12000rpm （~13400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P4加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12000rpm（~13400×g)离心2min，滤液收集在干净的2mL离心管中（自备）。
向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多容易导致RNA污染），上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP4的最大容积为700μL，所以需要分次过柱。
室温12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：将第7步中所得溶液分次过柱，每次均按以上条件操作。
向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2～5min，有助于更好地去除杂质。
向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液。
将吸附柱CP4重新放回收集管中，12000rpm （~13400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100～300μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm （~13400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤13。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

质粒DNA浓度及纯度检测：

得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

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